各種酶在最適温度範圍內，酶活性最強，酶促反應速度最大。在適宜的温度範圍內，温度每升高10攝氏度，酶促反應速度可以相應提高1至2倍。不同生物體內酶的最適温度不同。
動物組織中各種酶的最適温度為37至40攝氏度，微生物體內各種酶的最適温度為25至60攝氏度，但也有例外，如黑曲糖化酶的最適温度為62至64攝氏度，巨大芽孢桿菌、短乳酸桿菌、產氣桿菌等體內的葡萄糖異構酶的最適温度為80攝氏度，枯草桿菌的液化型澱粉酶的最適温度為85至94攝氏度。可見，一些芽孢桿菌的酶的熱穩定性較高。過高或過低的温度都會降低酶的催化效率，即降低酶促反應速度。最適温度在60攝氏度以下的酶，當温度達到60至80攝氏度時，大部分酶被破壞，發生不可逆變性，當温度接近100攝氏度時，酶的催化作用完全喪失。
