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革蘭染色成敗的關鍵在於脫色時間。革蘭氏染色四大基本步驟：結晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色、沙黃復染，其中乙醇脫色是關鍵。因為如果脫色過度，有可能會使革蘭氏陽性菌呈假陰性，如果脫色不夠，有可能使革蘭氏陰性菌呈假陽性。
革蘭氏染色是細菌學中廣泛使用的一種鑑別染色法，通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯緻密，革蘭氏染色屬復染法，即將標本固定後，先用龍膽紫染色，加碘液媒染後用酒精脫色，再用蕃紅復染
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