革蘭氏染色法的原理是革蘭氏陽性菌和陰性菌在化學和生理性質上差別比較大，染色體的反應也不一樣，一般陽性菌和碘和結晶紫的複合物結合比較牢固，不容易脫色，而陰性菌的結合相對比較弱，容易脫色，這是導致染色反應的主要依據。
細菌經過鹼性燃料結晶紫染色，後經過碘液進行媒染，然後用酒精脫色，在一定的條件下，有的細菌媒染後，顏色不被脫去，有的會被脫去，因此會把細菌分成兩類，不被脫去的被稱為革蘭氏陽性菌，脫去的則被稱之為革蘭氏陰性菌。脫色後可以在用紅色染料進行復染，陽性菌是紫色，陰性菌則被重新染上了紅色。很多有芽孢的桿菌和大部分的球菌，還有放射菌以及真菌杜輝呈現革蘭氏正反應，而弧菌、螺旋體以及大多數的致病性無芽孢桿菌則呈現出副反應。
